Dra.
María Teresa Pérez Gracia.
La introducción de la terapia combinada en el tratamiento
de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
ha conducido a una disminución sostenida de la carga vírica plasmática
por debajo de los límites de detección, reduciendo la progresión de
la enfermedad y la mortalidad en los países desarrollados. La imposibilidad
de suprimir de modo completo la replicación vírica da lugar a la selección
de variantes resistentes a las drogas. Aunque muchos factores pueden
contribuir al fracaso del tratamiento, la aparición de resistencias
juega un papel fundamental (1-7). Las variantes resistentes a drogas
surgen favorecidas por una serie de factores tales como la escasa
potencia del régimen terapéutico, la falta de seguimiento por parte
del paciente, los factores farmacológicos y el deterioro inmunológico
(Figura
1) (8). La rápida cinética de replicación del VIH, junto a
la elevada tasa de error en la actividad de la transcriptas inversa
(RT) (9-11) por cada ciclo replicativo de un genoma vírico (aproximadamente
1:105 nucleótidos procesados), da como resultado una elevada
diversidad genética dentro de la población vírica, a las que se denominan
“cuasiespecies”. Dado que la longitud del genoma vírico es de aproximadamente
10.000 pares de bases (pb), y si se producen 109 partículas
víricas/día, 102 partículas por célula infectada y 107
ciclos replicativos diarios, alrededor de 3.300 virus producidos cada
día van a llevar una determinada mutación y un número mucho menor
(<1) llevará una doble mutación. Entre estas cuasiespecies existen
las mutantes resistentes, que pueden ser seleccionadas por una terapia
inadecuada para suprimir la replicación vírica. En un modelo determinista
la resistencia emerge en una proporción relacionada con la frecuencia
de variantes ya existentes y su capacidad relativa de crecimiento
en presencia del fármaco (9). Este modelo se sustenta en las observaciones
realizadas en estudios con monoterapia de diferentes antirretrovirales.
Así por ejemplo, la resistencia a la nevirapina y a la lamivudina
emerge a las pocas semanas de iniciar la monoterapia debido a mutaciones
puntuales que dan lugar a una reducción de 1.000 veces en la actividad
de estos fármacos (1, 3). A diferencia de esto, la resistencia a los
dideoxinucleótidos emerge lentamente como resultado de mutaciones
que dan lugar a bajos niveles de resistencia y en el caso de la zidovudina
(ZDV) y los inhibidores de la proteasa el elevado nivel de resistencia
tiene lugar como consecuencia de una acumulación de múltiples mutaciones
a lo largo del tiempo (12, 13).Sin embargo, más acorde con los sistemas
biológicos, una visión alternativa contempla la posibilidad de eventos
estocásticos que podrían jugar un papel importante, como serían la
destrucción de la célula que alberga el virión resistente o la incapacidad
de la progenie viral resistente para encontrar una célula receptiva
(13). Este modelo estocástico puede ayudar a explicar las amplias
variaciones interindividuales observadas en la velocidad a la cual
la resistencia se desarrolla. La resistencia a los fármacos antirretrovirales
es determinada por mutaciones en los genes que codifican la proteasa
(PR) y la RT. Las mutaciones primarias son aquellas que alteran la
unión del fármaco a su diana y provocan un incremento en la cantidad
de fármaco necesario para inhibir a la enzima. En general, son relativamente
específicas de cada antivírico y aparecen rápidamente tras la presión
selectiva ejercida por el mismo, en un intento por evadir su acción.
Sin embargo, a menudo condicionan una desventaja cinética a la enzima.
Las mutaciones secundarias incrementan el nivel de resistencia mejorando
la capacidad replicativa (“fitness”) del virus que presenta mutaciones
primarias, por lo que también se conocen como mutaciones compensatorias.
Habitualmente las mutaciones secundarias tiene poco o ningún efecto
sobre el nivel de resistencia en ausencia de mutaciones primarias.
Aunque hay poca superposición en las mutaciones primarias, muchas
de las mutaciones secundarias son comunes para fármacos de la misma
familia, , es decir, para los análogos de nucleósidos, los no nucleósidos
y los inhibidores de la proteasa. Esto explica que las resistencias
cruzadas de grupo sean más frecuentes cuanto más tiempo ha estado
un paciente con fracaso virológico, es decir con persistencia de replicación
vírica, bajo el mismo tratamiento antirretroviral. En
las figuras 2, 3 y 4 aparecen las mutaciones primarias
y secundarias asociadas a resistencia a los análogos de nucleósidos,
no nucleósidos e inhibidores de la proteasa, respectivamente (13-18).
Los cambios que aparecen en otros genes distintos a PR y RT pueden
modular el fenotipo al margen de las mutaciones primarias o secundarias,
originando una aparente discordancia entre genotipo y fenotipo. Estos
resultados contradictorios son consecuencia de que las interacciones
entre ambos genes son aún pobremente comprendidas. La selección de la combinación antirretroviral en pacientes
tratados que presentan un fallo terapéutico exige técnicas de laboratorio
que permitan decisiones clínicas racionales. La capacidad de detectar
la resistencia a fármacos antirretrovirales puede ser de gran valor
en tales circunstancias, pero el coste, la complejidad y la ausencia
de validación dificultan trasladar esta tecnología del laboratorio
a la clínica. Los métodos actualmente disponibles para el diagnóstico
de resistencias a los antirretrovirales son de dos tipos: genotípicos
y fenotípicos. Los ensayos genotípicos para detección de resistencias
determinan la secuencia de nucleótidos de los genes PR y RT. Estos
ensayos pueden realizarse mediante RT-PCR, a partir de ARN plasmático,
o PCR del ADN proviral. Las mutaciones en el producto amplificado
son reconocidas mediante: a) secuenciación automática cíclica (por
ejemplo con un secuenciador Perkin-Elmer, Pharmacia o Visible-Genetics);
b) hibridación con sondas específicas que discriminan los virus mutantes
del tipo salvaje en posiciones específicas (la técnica de LIPA) (19);
y c) ensayos de mutaciones puntuales mediante la utilización de chips
de hibridación múltiple (prueba de Affimetrix) (20). La secuenciación
aporta una gran cantidad de datos sobre los genes RT y PCR, probablemente
más de los que se precisan para adoptar decisiones clínicas. Las otras
técnicas aportan datos de los codones específicos implicados en la
resistencia. Los ensayos fenotípicos aplicados a resistencias consisten
en determinar en un aislamiento viral (fenotipo) la capacidad de inhibición
por un fármaco. La susceptibilidad a un fármaco viene definida por
la cantidad requerida de éste para inhibir “in vitro” al 50%, 90%
o 95% la producción vírica (es lo que se denomina IC50, IC90 o IC95,
respectivamente). En general, cambios de 4 veces o más en la IC50
son considerados significativos y sugieren resistencia al fármaco
estudiado (21-24). El análisis
de resistencias fenotípicas puede hacerse a partir del aislamiento
de virus del paciente en un cocultivo con linfocitos de donante o
en una línea linfoide de laboratorio. Los resultados varían dependiendo
de la línea celular utilizada. Para obviar este problema, se ha desarrollado
una prueba que utiliza virus recombinantes (RVA, recombinant virus
assay), obtenidos tras extraer del plama y amplificar por RT-PCR,
los genes de la TI y de la proteasa, e insertarlos en un genoma defectivo
en estas regiones de pol.
El resultado son virus recombinantes que tienen en común los genes
de envuelta, accesorios y reguladores (eg,
tat, vif, nef) pero que llevan la región pol
del paciente a estudiar (Figura
5) (21-23). Este proceso
permite obtener resultados más comparables y eliminar los problemas
de los estudios fenotípicos con cultivo celular de aislados de virus
completos del paciente. Actualmente, se dispone de dos pruebas comerciales
(Virco y ViroLogics) que utilizan el principio de RVA para examinar
resistencias fenotípicas a los antirretrovirales. Ambos tipos
de ensayos, tanto el genotípico como el fenotípico, aun siendo complementarios
comparten inconvenientes, como la falta de sensibilidad para detectar
la presencia de cuasiespecies minoritarias (<20%), así como la dificultad de obtener resultados a
partir de muestras con carga vírica de menos de 1.000 copias de ARN-VIH/ml
de plasma. Esto explica que en los individuos con una viremia baja
o indetectable sea difícil la realización de estudios de genotipos.
Los ensayos genotípicos tienen la ventaja sobre los fenotípicos de
ser menos costosos y más rápidos y fáciles de realizar. La secuenciación
tiene un gran valor para identificar nuevas mutaciones que confieren
resistencias, pero esta información es útil clínicamente cuando la
base genética de la resistencia ha sido determinada. Una limitación
importante de las pruebas genotípicas es la dificultad para calcular
las consecuencias de las interacciones mutacionales en el fenotipo.
Los ensayos de resistencias de fármacos pueden ser útiles en varias
circunstancias. Estas incluyen la elección del tratamiento inicial,
la prevención de la transmisión vertical y la profilaxis ante un contacto
de riesgo. En pacientes naive la elección de un tratamiento inicial
exitoso puede ser trascendental para el paciente y el riesgo de adquisición
de virus resistentes y que se replican en ese momento puede ser importante.
En varios estudios en Estados Unidos y Europa, la transmisión de virus
resistentes parece ocurrir en alrededor de un 10% de los sujetos con
infección aguda por el VIH (8,25,26) pero existe una creciente preocupación
debido a la posibilidad de transmisión de virus multirresistentes
(26,27,28). En el caso de las mujeres seropositivas embarazadas, la
terapia antirretroviral reduce considerablemente el riesgo de transmisión
vertical, de modo que la exclusión de resistencias puede permitir
la elección de un mejor tratamiento para la madre. En el caso de un
contacto de riesgo, bien sea por accidente laboral con sangre de pacientes
infectados o tras un contacto sexual con una persona seropositiva,
el tratamiento antirretroviral puede reducir el riesgo de infección
y no debe demorarse su administración en espera del conocimiento del
patrón de resistencias que tienen los virus infectantes. Sin embargo,
esta información puede aconsejar modificar la combinación administrada
desde un principio cuando el resultado esté disponible. Los avances en las pruebas genotípicas y fenotípicas
para la detección de resistencias de VIH a los fármacos antirretrovirales
permitirán su utilización en el manejo terapéutico de los individuos
infectados. Aunque existen algunas cuestiones por resolver, los resultados
preliminares sugieren que podrían ser beneficiosas en la elección
del tratamiento en pacientes que presentan un fracaso terapéutico,
bien para la selección de una pauta alternativa, o para la elección
de terapias de rescate idóneas. Es preciso unificar criterios de interpretación,
así como establecer controles de calidad con el fin de estandarizar
los resultados al margen del método utilizado. Cada vez parece más
próximo el momento en que la determinación de resistencias llegue
a ser una prueba rutinaria en el manejo clínico de la infección por VIH.
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