Laboratorio Nacional de Referencia para Vigilancia Sanitaria. Hospital
Pediátrico Docente “William Soler”. Evaluacion Cuantitativa de Eficacia de un Esterilizador Químico
que Autores: Sonia Chiroles Despaigne.
[2]
Odalys
Villavicencio Betancourt.
[3]
Dirección: Calle 10 # 61 e/ C y D Lawton. C.P. 10700 Ciudad Habana. Cuba. RESUMEN
En este ensayo se desarrolla un método de análisis microbiológico,
que permite evaluar la eficacia del esterilizador modelo 130 LF marca
Matachana, de fabricación española, cuyo
principio de funcionamiento se basa en el uso de temperaturas bajas,
empleando formaldehído al 2% en fase de vapor, como agente esterilizante. Las evaluaciones realizadas
a esta tecnología, fueron comparadas con el método de referencia de
esterilización química, que utiliza una mezcla de CO2 con
óxido de etileno a bajas temperaturas. Para el análisis de eficacia se emplean fragmentos de catéteres
compuestos químicamente por cloruro de polivinilo (PVC) y fluoroetileno propileno o teflón (FEP), los que fueron inoculados
previamente con cepas bacterianas de referencia, productoras de endosporas ( Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis) suspendidas en medios de cultivos con adición
de materia orgánica e inorgánica, lo que permite valorar el proceso
en ambiente restringido de difusión del agente esterilizante. El resultado de las evaluaciones para el equipo esterilizador
que emplea formaldehído al 2% en fase vapor fue satisfactorio, obteniéndose
100% de esterilidad para las condiciones planteadas, por cada ciclo.
INTRODUCCION La esterilización de dispositivos
médicos termosensibles empleando esterilizantes químicos en fase de vapor a bajas
temperaturas, ha sido aceptada
de forma universal como un paso esencial en el control de infecciones
nosocomiales en los centros de salud. La metodología de referencia emplea el gas óxido de etileno
(OxEt) como
agente esterilizante químico, cumpliendo los límites de reducción
en la carga microbiana normados para los procesos de esterilización(1)
(Greene V, 1995). El principio de funcionamiento de esta metodología requiere
de la remoción de residuos generados durante el proceso, los cuales
se adhieren a las superficies de los dispositivos reprocesados. La eliminación total o disminución
de residuos a límites permisibles normados requiere de un proceso
de detoxificación que va desde 48 horas hasta 10 días(2) (FDA, 1978) o más en dependencia
del aumento del número de reesterilizaciones
realizadas a un mismo dispositivo(3) (Hidalgo R, 2002). La tecnología que emplea formaldehído al 2% como agente esterilizante
en fase de vapor a bajas temperaturas es una alternativa reciente
dentro de este tipo de metodología. El formaldehído en su modo de acción a bajas concentraciones,
lisa pared celular de los microorganismos, alcaliniza grupos amino
y sulfhidrilo de proteínas y los átomos de nitrógeno del anillo
de las bases de purina(4)
(Favero MS, 1983). Como proceso alternativo
ha mostrado actividad esporicida y bactericida
bajo determinadas condiciones de temperatura y humedad, estos efectos
fueron demostrados primeramente para Bacillus anthracis en un proceso a 700C desarrollado
por Esmarch en 1902(5) (Esmarch E, 1902). En estudios posteriores realizados por Nordgren
en 1939(6) (Nordgren C, 1939),
se demostró la importancia de la humedad relativa y la evacuación
de la cámara, antes de la admisión de formaldehído–vapor, garantizando
la penetración adecuada del agente esterilizante en el interior de
la carga. Este proceso comienza a usarse en la práctica hospitalaria
en la década de 1960. Estudios realizados por Alder,
Gingell y Mitchell(7)
(Mitchell JP, 1975) en el período comprendido
entre 1971-1975 permitieron establecer un ciclo básico de uso de formaldehído
(2ml/ft3) a 730C durante 2 horas minimizando
el daño a los equipos termosensibles, sin pérdida
de la actividad esporicida. Comprobaron además la disminución de niveles de residuos
de formaldehído sobre dispositivos de goma y polietileno, alcanzando
valores por debajo de 0.45 ppm (específicamente
en tubos de PVC). Establecieron controles para el proceso mediante el uso de
indicadores físicos- químicos y biológicos aún empleados en la actualidad.
En sus inicios, fue un proceso designado para el procesamiento
de citoscopios y dispositivos similares, desde entonces se
ha ido perfeccionando el equipamiento para garantizar el control necesario
para la esterilización de una amplia variedad de dispositivos médicos. En la actualidad el proceso consta de 2 ciclos de esterilización,
cada uno con 5 etapas en la que primero se elimina el aire
de la cámara esterilizadora, haciendo pulsos de vapor para obtener
la humedad suficiente y el pre-acondicionamiento
de la carga, posteriormente se realizan pulsos de formaldehído, concentrados
al 2%, alternando con pulsos de vapor. Al terminar el tiempo de esterilización, los residuos de
formaldehído son eliminados haciendo un ciclo de vacío y pulsando
aire estéril al interior de la cámara. Se restablece la presión atmosférica
y no requiere de tiempo de aireación lo que representa una ventaja
que al concluir el programa seleccionado, después de la apertura de
la cámara, el material puede usarse de forma inmediata o almacenarse
hasta el momento de su uso. Teniendo en consideración la necesidad cada vez más vital
de “reprocesar” artículos termosensibles,
clasificados como críticos que resultan de una creciente demanda actual
y tomando como base el criterio de la compatibilidad entre los dispositivos
y el agente esterilizante nuestro equipo de trabajo desarrolló un
ensayo evaluativo basado en el método de “sobre muerte” a un equipo
esterilizador que basa su principio de funcionamiento en el uso del
formaldehído al 2% en fase de vapor a bajas temperaturas comparado
con la metodología de óxido de etileno, tecnología de referencia. MATERIALES Y METODOS
Se realizó un estudio comparativo para evaluar la
eficacia, o el efecto microbicida del equipo esterilizador Matachana,
modelo 130 LF, de fabricación española,
el cual tiene acoplado un microprocesador, que permite el desarrollo
de dos programas de esterilización empleando bajas temperaturas. Como
agente esterilizante, utiliza el formaldehído al 2% en fase de vapor. Uno de los procesos se realiza a 500C,
consta de 20 pulsos de formaldehído, un tiempo de esterilización de
120 minutos a una presión de 123 mbar y tiene una duración total de aproximadamente
5 horas incluida la aireación. El otro ciclo se realiza a una temperatura de 600C,
consta de 15 pulsos de formaldehído, un tiempo de esterilización de
60 minutos a una presión de 200 mbar y tiene
una duración total de aproximadamente 3 horas incluida la aireación. El método de referencia usado para establecer la comparación,
fue el proceso de esterilización química, que emplea óxido de etileno
como agente esterilizante y que se desarrolla a bajas temperaturas.
Se utiliza una cámara esterilizadora de fabricación
japonesa, modelo SAKURA adaptada para la realización de este proceso.
Consta de un solo programa, en el cual se mezclan el óxido de etileno y el CO2 en una proporción
de 20/80% respectivamente. La concentración de gases en el interior de la cámara
es de 500-1000 mg/L, una humedad relativa
entre 60-90% y una temperatura que oscila entre 55-600C,
con un tiempo de esterilización, comprendido entre 4-6 horas, la apertura
de la cámara, se realiza 24 horas después de concluido el proceso,
teniendo lugar una destoxificación en horno
a 600C aproximadamente
durante 8 horas y un tiempo de aireación entre 7-10 días en
un local ventilado. Para
la validación, se aplica un método microbiológico estándar establecido
en la norma(8)
(ASTM, 1996), que permite cuantificar
el índice de reducción microbiana, es específico para procesos que
emplean agentes esterilizantes químicos en estado gaseoso a bajas
temperaturas, exponiendo el proceso de esterilización a dos condiciones
que representan “el caso más desfavorable”, bloqueando el paso del
agente esterilizante. En
la neutralización del proceso se utiliza materia orgánica (proteínas) e inorgánica (sales). Diseño experimental Se
emplearon fragmentos de catéteres de cloruro de polivinilo (PVC) con
diámetro interno de 3mm y 2 cm de largo,
para confeccionar los indicadores de proceso, que funcionaron como
soporte microbiano. Los mismos, fueron primeramente esterilizados
por óxido de etileno y posteriormente inoculados asépticamente con
una suspensión microbiana concentrada 1.0 x 106 ufc/
10 µL de medio líquido triptona
soya (TSC) (OXOID), triptona soya más 0.5%
de fracción V de albúmina bovina (BDH) y triptona
soya más 0.65% de cloruro de sodio (MERCK). El
inóculo, se dejó secar durante 12 horas a temperatura ambiente, dentro
de placas de petri, en el interior de una
cabina de seguridad biológica clase II A de fabricación cubana. Estos
controles de proceso, fueron embalados en papel de uso médico, compuesto
por una capa de papel krafft y otra de plástico
bilaminado (
polipropileno y poliester) y sellados. Se
realizaron 5 ciclos de esterilización por cada programa, para ambos
esterilizadores. Los
paquetes de prueba, conteniendo cada uno 3 fragmentos de catéteres,
fueron colocados en la parte delantera, media y posterior en el interior
de la cámara esterilizadora, a razón de 3 paquetes por ciclo, completando
un total de 15 pruebas.
Para
la confección de los controles de proceso, se utilizaron bacterias
productoras de endosporas, clasificados
estos microorganismos altamente resistentes al proceso de esterilización
química. Para
evaluar el proceso que emplea formaldehído en fase de vapor, se utilizó
la cepa microbiana de referencia Bacillus stearothermophilus
ATCC 7953 lote: S-231P concentrada a 1.0 x 105 esporas/unidad
(SGM BIOTECH, U.S.A.). Para
el control del proceso que emplea óxido de etileno se utilizó la cepa
microbiana de referencia de Bacillus subtilis var. niger
ATCC 9372 lote: G-91P concentrada
a 1.0 x 106 esporas/unidad (SGM BIOTECH, U.S.A.).
Se
conformaron 3 réplicas por cada condición planteada por ciclo de esterilización. Cada
paquete de pruebas, fue asépticamente procesado, colocando cada fragmento
de catéter en un tubo de ensayo que contenía medio de cultivo líquido
para restituir el inóculo, el mismo fue homogeneizado vigorosamente
durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se
realizaron diluciones seriadas. Cada dilución fue cuantificada por
duplicado, sembrando en placas de Petri
que contenían 10 mL de medio triptona soya agar. La extensión se realizó por espátula de Drigalski. Los
medios de cultivos (líquidos y sólidos) sembrados, fueron incubados
a la temperatura correspondiente, para permitir el crecimiento de
cada microorganismo. Posterior a los tiempos de incubación, se determinó
presencia o no de turbidez en el tubo contenedor del catéter; de no
observarse turbidez, se declara el fragmento de catéter estéril; si
se observa turbidez, se procede a un subcultivo
del medio para especificar crecimiento del microorganismo. Para
evaluar los medios sólidos, establecimos como condición: de no existir
crecimiento, se declara el fragmento de catéter estéril, de existir
crecimiento, el límite de detección por placa es de 7ufc/fragmento
de catéter, teniendo en cuenta que el mismo, fue restituido en 2 mL
de medio, del cual se tomaron 100 µL para
realizar la siembra, por lo que esta cantidad fue representada como
1 log10 Los
controles negativos, estaban formados por fragmentos de catéteres estériles no inoculados, mantenidos asépticamente
a temperatura ambiente hasta que se concluyeron los ciclos de esterilización.
Fueron sometidos al mismo procedimiento de ensayo microbiológico. Los
controles positivos estaban formados por fragmentos de catéteres estériles inoculados, mantenidos asépticamente
a temperatura ambiente hasta que se concluyeron los ciclos de esterilización.
Fueron sometidos al mismo procedimiento de ensayo microbiológico.
RESULTADOS El objetivo del estudio, fue determinar la eficacia del proceso
o efecto de letalidad sobre una población microbiana, formada por
bacterias productoras de endosporas, realizado
por el esterilizador químico que emplea formaldehído–vapor a bajas
temperaturas, comparado con el método de referencia utilizado para
este tipo de esterilización (Óxido de etileno).
Para garantizar la
efectividad del ensayo, cada
uno de los esterilizadores fue probado con la cepa microbiana de referencia,
recomendada por los estándares aplicados. Los valores obtenidos, resultaron del promedio de 6 réplicas
por cada condición, fueron expresados como el logaritmo sobre la base
de 10 de la concentración microbiana recuperada en cada una de las
diluciones. El valor 0, representa la ausencia de crecimiento del microorganismo,
para esa dilución. En la tabla I se observan los valores correspondientes a
los controles de biomasa microbiana recuperada por dilución en medio
de cultivo triptona soya caldo, tanto en
presencia de materia orgánica, representada por 0.5% de albúmina bovina
como en presencia de materia inorgánica, representada por 0.65% de
cloruro de sodio, partiendo de una concentración de 105
ufc/10µL, como resultado de las diluciones realizadas se obtiene
la disminución esperada correspondiente a cada suspensión. Posterior al tratamiento con formaldehído en ambos ciclos
(500C-600C), no se recuperaron valores de biomasa,
correspondiéndose el valor 0 con la ausencia de crecimiento microbiano
en ambos ciclos de esterilización por formaldehído en presencia de
ambas condiciones en las que fue suspendida la cepa microbiana
Bacillus stearothermophilus. En
la tabla II se exponen los resultados del ensayo realizado al esterilizador
químico que emplea óxido de etileno, el cual constituye el método
de referencia, se observan los valores correspondientes a los controles
de biomasa microbiana recuperada por dilución en medio de cultivo
triptona soya caldo, tanto en presencia
de materia orgánica, representada por 0.5% de albúmina bovina como
en presencia de materia inorgánica, representada por 0.65% de cloruro
de sodio, partiendo de una concentración de 106 ufc/10µL, como resultado de las
diluciones realizadas se obtiene la disminución esperada correspondiente
a cada suspensión. Posterior al tratamiento con óxido de etileno a una temperatura
de 550C, no se recuperaron valores de biomasa, correspondiéndose
el valor 0 con la ausencia de crecimiento microbiano en presencia
de ambas condiciones en las que fue suspendida la cepa microbiana Bacillus subtilis.
DISCUSION DE RESULTADOS Como resultado del ensayo de eficacia, se alcanzó el 100%
de esterilidad en cada fragmento de catéter por cada dilución sembrada
y su réplica; con relación a las 2 condiciones planteadas y para cada
uno de los ciclos del esterilizador evaluado, en comparación con la
tecnología de referencia (óxido de etileno), según se observa en las
tablas I y II. Se comprobó ausencia de crecimiento de las cepas microbianas
de referencia (Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis), utilizadas en las condiciones planteadas
para la evaluación (albúmina 0.5% y NaCl
0.65%) posterior al tratamiento con el agente esterilizante, comparados
con la biomasa recuperada en los fragmentos de catéter no procesados,
tomados como controles positivos. Nuestros resultados son coincidentes con los obtenidos por
Manresa en 1997(9) (Manresa, 1997), aplicando la metodología
de ensayo establecida en la norma DIN 58948-14 y la cepa microbiana
de referencia Bacillus stearothermophilus
ATCC 7953 para ambos procesos
(500C-600C), en los que obtuvo ausencia de crecimiento
para las 9 pruebas que realizó, comparado con el crecimiento obtenido
en la muestra control positivo. El resultado de nuestro estudio, difiere del resultado obtenido
por Alfa en 1998(10) (Alfa M, 1998), en el cual evalúa
la eficacia del proceso que emplea ácido peracético
como esterilizante líquido utilizado a 560C comparado con
100% de óxido de etileno, para el que desarrolla el
método de “el caso más desfavorable” establecido por la ASTM. En sus
resultados, obtuvo 100% de esterilidad para los fragmentos de catéter
tratados por ácido peracético y un 50% de
crecimiento microbiano representado por 3 Log10 de ufc/fto de catéter para la cepa de Bacillus subtilis en presencia de cloruro de sodio posterior al tratamiento con óxido de
etileno. Según los primeros estudios realizados a procesos de esterilización
que emplean gas a bajas temperaturas (óxido de etileno y formaldehído)
por Abbott, Cockton
y Jones en 1956(11) (Abbott
C F, Cockton J, Jones
W, 1956) sobre el efecto de
oclusión de esporas en presencia de materia orgánica e inorgánica,
se observó específicamente, que el sustrato compuesto por cristales
de sales era capaz de bloquear más la difusión del agente esterilizante.
Estudios realizados por Doyle y
Ernst en 1967(12) (Doyle
J E y Ernst R R,
1967), demostraron que este fenómeno también ocurría en procesos de
humedad y calor seco a altas temperaturas, por lo que no estaba limitado
solamente a procesos realizados a bajas temperaturas. Estudios recientes, realizados por Alfa en 1996(13)
(Alfa M, 1996), en los que analizó la eficacia de peróxido de hidrógeno
en fase de vapor comparado con 100% de óxido de etileno a bajas temperaturas
(500C-600C), en presencia de materia inorgánica,
obtiene resultados coincidentes con las primeras evaluaciones realizadas
por Abbott en 1956. Analizando nuestra evaluación expuesta en las tablas I y
II, podemos plantear, que los resultados obtenidos con relación al
proceso de formaldehído, se deben al modo de aplicación del agente
esterilizante, el cual es inyectado a la cámara de forma fraccionada,
o sea, intercalándose con pulsos de vapor saturado cada 15 minutos,
lo cual ayuda a la disolución de los cristales tanto de sales como
de proteínas, facilitando la penetración del agente esterilizante.
La admisión de formaldehído gaseoso a la cámara en sus inicios,
se realizaba por un total de 4 pulsos, seguida de evacuaciones de
aire seco, lo cual contribuía a
la desecación de los cristales y no a su disolución(14)
(Alder V G, 1968). La modificación actual de la metodología, permite la obtención
de mejores resultados con relación a la efectividad del agente esterilizante
en su modo de acción, obteniéndose 100% de efecto microbicida para
este tipo de esterilización química y la total ausencia de crecimiento
de Bacillus stearothermophilus
en presencia de materia orgánica e inorgánica. Con relación a los resultados obtenidos posterior al tratamiento
por óxido de etileno expuestos en la tabla II, valoramos el uso mixto
en una proporción de 20% del agente esterilizante con 80% de CO2, en presencia de altos niveles
de humedad, lo que facilita la disolución de los cristales. Alfa en
sus estudios utiliza 100% del agente esterilizante, no existe mezcla
del mismo con otros gases. CONCLUSIONES Se
comprobó alta eficacia o 100% de efecto microbicida para el proceso
de esterilización química que emplea formaldehído a bajas temperaturas,
en las muestras de catéteres inoculadas con 106 ufc/
mL de Bacillus stearothermophilus, obteniendo la total ausencia de
crecimiento en presencia de materia orgánica e inorgánica. Ver
Tabla I.- Eficacia del esterilizador FVBT
en la eliminación de esporas bacterianas de Bacillus stearothermophilus en presencia de materia orgánica
e inorgánica.
TSC+0.5% de albúmina- neutralizador orgánico
del proceso Control
(+) – Biomasa Microbiana Recuperada/ dilución. Valor promedio de 6
réplicas Ver
Tabla II.- Eficacia de la esterilización por óxido de etileno
en la eliminación de esporas bacterianas de Bacillus subtilis var niger
en presencia de materia orgánica e inorgánica. TSC+0.5%
de albúmina- neutralizador orgánico del proceso
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